Triatoma venosa y Panstrongylus geniculatus cuestionan la certificación de interrupción de la transmisión vectorial de Trypanosoma cruzi por Rhodnius prolixus en el oriente de Colombia

Introducción

La enfermedad de Chagas (EC) es una zoonosis causada por el protozoo Trypanosoma cruzi, que se transmite a los seres humanos principalmente por insectos de la subfamilia Triatominae (Hemiptera: Reduviidae) mediante transmisión estercoraria [1]. En América Latina se han reportado más de 150 especies de chinches triatominas; sin embargo, tres especies (Triatoma infestans, Triatoma dimidiata y Rhodnius prolixus) son responsables de la mayoría de los casos de transmisión vectorial en el continente [2]. En Colombia se han reportado 26 especies de triatominos, 16 de las cuales se han encontrado naturalmente infectadas con T. cruzi [3,4]. El conocimiento de los perfiles entomológicos subyacentes es fundamental para diseñar programas eficaces de control vectorial, en particular para la enfermedad de Chagas, cuyas iniciativas cuentan con recursos muy limitados [5,6].

Los vectores triatominos han sido objeto histórico de algunas iniciativas internacionales, entre ellas INCOSUR (Iniciativa de los Países del Cono Sur), IPCAM (Iniciativa de los Países de Centroamérica y México) e IPA (Iniciativa de los Países Andinos), con el fin de controlar la enfermedad de Chagas en América del Sur, Central y del Norte [7]. En 2011, seis países de IPCAM certificaron la eliminación de R. prolixus [8,9]; sin embargo, recientemente se volvió a encontrar esta especie infestando viviendas y estructuras peridomésticas en México [10]. Además, en las regiones de IPCAM otras especies pueden ocupar el nicho que dejaron las especies anteriores, como ocurre con T. dimidiata en áreas antes infestadas por R. prolixus [7,11–13]. En los países de INCOSUR se realizaron fumigaciones extensivas con insecticidas para lograr la eliminación de T. infestans [14,15]. No obstante, posteriormente se encontraron focos residuales de T. infestans en Brasil [16–19], algunos procesos de (re)infestación en Perú relacionados con fuentes externas [20,21] e infestaciones por otras especies nativas en diferentes territorios de INCOSUR [22,23]. Por ello, los principales desafíos de estos nuevos escenarios para las distintas iniciativas son: los esfuerzos dirigidos a otras especies nativas y a poblaciones resistentes a insecticidas, más investigación y el financiamiento de sistemas de vigilancia sostenibles a largo plazo [7].

Siguiendo el modelo de los programas de eliminación de INCOSUR para T. infestans, Colombia priorizó la eliminación de R. prolixus domiciliado debido a su relevancia epidemiológica, su amplia distribución y la presencia de poblaciones estrictamente domiciliadas [24]. El departamento de Boyacá, ubicado en la región andina oriental, es uno de los departamentos más endémicos para la enfermedad de Chagas [25]. Históricamente, las instituciones gubernamentales han implementado programas de control y prevención para eliminar a R. prolixus intradomiciliario en esta región. Como resultado, Boyacá cuenta con 24 municipios certificados como libres de transmisión intradomiciliaria de T. cruzi mediada por R. prolixus, lo que lo convierte en el departamento con el mayor número de municipios certificados como libres de T. cruzi en Colombia [26–28]. Sin embargo, en Boyacá se han descrito nueve especies de triatominos, de las cuales cinco (T. dimidiata, Triatoma venosa, Panstrongylus geniculatus, Panstrongylus rufotuberculatus y Rhodnius pictipes) han sido identificadas recientemente como infectadas con T. cruzi [29]. Se han descrito situaciones epidemiológicas similares en otros países con un control entomológico exitoso de T. infestans, donde la reinfestación por especies nativas, como Triatoma brasiliensis y otras, mantiene el riesgo de transmisión de T. cruzi después de la eliminación del vector primario [7]. Varios estudios realizados en Boyacá, que evalúan las características ecológicas, moleculares y espaciales de la fauna triatomina después de la certificación, han mostrado que especies como T. dimidiata y T. venosa son los vectores nativos más abundantes en la región. Ambas especies tienen la mayor importancia epidemiológica debido a los niveles de infestación domiciliaria en el nororiente y el suroccidente, respectivamente [26,30,31]. Además, estas especies de vectores presentan niveles altos de infección por T. cruzi y con frecuencia se alimentan de seres humanos y animales domésticos [26,30]. Estas características ecológicas subrayan la necesidad de realizar estudios serológicos para obtener una visión más precisa del riesgo de exposición a la EC en personas que viven en áreas donde la principal especie transmisora está controlada [26,30].

El municipio de Miraflores, ubicado al suroccidente de Boyacá, es un municipio certificado por la OPS como libre de transmisión de T. cruzi por R. prolixus intradomiciliario desde 2019 [28]. No obstante, un estudio reciente realizado en este municipio mostró índices relevantes de infestación y colonización, de 14.5% y 16.4% respectivamente, y niveles altos de infección por T. cruzi en T. venosa recolectados en viviendas rurales [29]. La presencia de T. venosa en los hogares y su posible participación, junto con animales domésticos y seres humanos, en el ciclo de transmisión de T. cruzi genera preocupación entre los residentes y constituye una amenaza para la salud pública [26,29]. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo describir las características eco-epidemiológicas de la transmisión de T. cruzi en un área rural del municipio de Miraflores mediante: (i) una evaluación transversal de la infección por T. cruzi en poblaciones humanas y caninas utilizando herramientas serológicas y moleculares; (ii) encuestas entomológicas; (iii) la determinación de la infección natural por T. cruzi y de la fuente de alimento sanguíneo en triatominos; y (iv) la evaluación de la infección por T. cruzi en mamíferos sinantrópicos.

Materiales y métodos

Declaración de ética para las evaluaciones en seres humanos y animales

El Comité de Ética en Investigación (sesión del 16 de noviembre de 2021) y el Comité de Experimentación Animal (sesión del 9 de diciembre de 2021) de la Universidad de Antioquia aprobaron la participación de seres humanos y de animales en este estudio, respectivamente. Todos los participantes adultos (de 18 años o más) firmaron el formulario de consentimiento informado. Los niños (menores de 18 años) fueron incluidos en el estudio después de que sus padres o tutores firmaran el consentimiento informado en su nombre. Todos los animales fueron manejados en estricto cumplimiento de las buenas prácticas de bienestar animal, tal como las define el código colombiano de práctica para el cuidado y uso de animales con fines científicos, establecido por la Ley 84 de 1989.

Área de estudio

Este estudio se llevó a cabo en el municipio de Miraflores (5° 11' 43.46" N; 73° 8' 39.55" W), ubicado en el departamento de Boyacá, en la región andina de Colombia (Figura 1). Es una región tropical subhúmeda, con una precipitación anual de 1300 mm y una temperatura media anual de 15.5 °C. Las temporadas de lluvia son bimodales y se extienden de abril a junio y de agosto a noviembre. La temporada seca se extiende de diciembre a marzo. El área de estudio se dedica principalmente a la producción ganadera y a cultivos como café, caña de azúcar, maracuyá y pitahaya, entre otros.

Figura 1. Ubicación geográfica del área de estudio. Arriba a la izquierda: departamento de Boyacá, Colombia. Abajo a la izquierda: municipio de Miraflores, departamento de Boyacá. A la derecha: veredas rurales seleccionadas para el estudio: Arrayán, Chapacía, Matarredonda Abajo, Morro Abajo, Pueblo y Cajón, y Suna Abajo. El mapa fue generado con ArcGIS Pro 3.1.2 (ESRI, Redlands, CA, EE. UU.). El mapa base se obtuvo del repositorio de mapas base de ESRI, Earthstar Geographics Imagery. Las capas de país, departamento y municipio se descargaron del catálogo de ESRI ArcGIS Online, creadas por el Instituto Geográfico Agustín Codazzi (IGAC), bajo licencia Creative Commons CC BY 4.0. Disponible en el artículo original: enlace.

Diseño del estudio y tamaño de muestra

Este estudio transversal se realizó de diciembre de 2021 a diciembre de 2022. Se seleccionaron seis veredas por conveniencia, con base en la accesibilidad, la cercanía al centro urbano y los reportes previos de triatominos [29]. Las seis veredas rurales seleccionadas fueron: Arrayán, Chapacía, Matarredonda Abajo, Morro Abajo, Pueblo y Cajón, y Suna Abajo (Figura 1 y Tabla 1). Los criterios de inclusión para la recolección de muestras humanas fueron: personas de todas las edades residentes en las veredas seleccionadas, que aceptaran participar y que firmaran el consentimiento informado. Los participantes fueron reclutados mediante visitas casa por casa en cada vereda. Para obtener el marco muestral se realizó un censo poblacional en las seis veredas, en el que se registró información sobre el número de viviendas habitadas, el número de personas y la presencia de animales domésticos. En el censo se registraron en total 283 hogares habitados por 1458 personas. Los tamaños de muestra (n) apropiados y representativos para la encuesta en humanos se calcularon con el software Epi-info V 2000, con los siguientes parámetros: nivel de confianza del 3%, frecuencia de infección del 2.6% (según Suescún [32]) y error del 3%. Estos cálculos arrojaron un tamaño de muestra necesario de 101 personas. Se utilizó un muestreo probabilístico estratificado por hogar dentro de cada vereda, con probabilidad proporcional al tamaño; se encuestaron 118 hogares, de los cuales 80 proporcionaron muestras biológicas humanas o caninas. El muestreo por conveniencia a nivel de hogar se utilizó para obtener las muestras biológicas, mientras que la encuesta domiciliaria y la búsqueda de triatominos se realizaron en todos los hogares. La encuesta a nivel de hogar proporcionó información sobre los avistamientos de animales silvestres, por parte de los residentes, dentro o alrededor de la vivienda y del predio, así como sobre las áreas donde realizan actividades domésticas (lavar ropa, cocinar, criar aves de corral y cultivar), con un radio máximo de 30 metros desde la vivienda.

Recolección y procesamiento de triatominos

En cada localidad de estudio se realizaron tres encuestas entomológicas entre diciembre de 2021 y diciembre de 2022. Todos los procedimientos fueron realizados por técnicos de la Secretaría de Salud del departamento de Boyacá (BDHS), siguiendo los protocolos nacionales de vigilancia entomológica [33]. Los triatominos se buscaron en 80 hogares, tanto en el interior (intradomicilio) como en el exterior (peridomicilio), durante 30 minutos siguiendo el mismo protocolo, utilizando una linterna para revisar grietas y hendiduras en las paredes, detrás de marcos de cuadros colgados en la pared, detrás de los muebles, dentro de los armarios y, especialmente, debajo de la ropa de cama. Los triatominos fueron transportados al laboratorio, registrados e identificados mediante claves taxonómicas [34].

Todos los triatominos recolectados fueron evaluados para detectar infección por T. cruzi mediante métodos parasitológicos y moleculares en la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Las heces se obtuvieron por compresión abdominal, se diluyeron en 300 µL de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) (pH: 7.2) y se utilizaron para la extracción de ADN de T. cruzi. El ADN genómico se extrajo a partir de 200 µL de heces utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Estudio serológico en seres humanos y caninos

Seres humanos. Se recolectaron aproximadamente 5 mL de sangre total en tubos vacutainer mediante venopunción, y cada muestra fue sometida a pruebas serológicas y moleculares. Una alícuota de 200 µL se almacenó en solución K3-EDTA para diagnóstico molecular. Para obtener el suero, 3 mL de la muestra se centrifugaron durante 15 minutos a 1000 g; el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 1.5 mL, que se almacenó a −20 °C hasta su procesamiento. Todos los pacientes fueron evaluados mediante dos pruebas de ELISA con principios diferentes, de acuerdo con las recomendaciones del Instituto Nacional de Salud de Colombia: un ELISA comercial de antígenos totales (ELISA Chagatest Wiener) y un ELISA de antígenos recombinantes (CHAGATEK ELISA, Microelisa system), siguiendo las instrucciones del fabricante. El kit utiliza un valor de corte calculado a partir del valor promedio de la densidad óptica (DO) de los controles negativos, al que se suma 0.2 para determinar los valores positivos. Las muestras discordantes fueron analizadas mediante una tercera prueba serológica adicional: el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI), en el que las muestras discordantes con títulos de 1:40 o más se consideraron positivas. Los sujetos con resultados positivos fueron remitidos al hospital regional para su evaluación, seguimiento y consideración de un posible tratamiento, de acuerdo con el Programa Departamental de Chagas.

Reservorio canino. Los perros fueron seleccionados de los hogares participantes cuyos propietarios estuvieron interesados en la prueba para animales. Los criterios de inclusión para estos mamíferos fueron: (I) haber nacido y crecido en el área de estudio, (II) tener un propietario identificable y (III) contar con el consentimiento informado de sus propietarios. De cada animal se recolectaron dos muestras de sangre de 5 mL de la vena radial, utilizando tubos vacutainer con suero y con EDTA, y se almacenaron a 4 °C hasta su procesamiento. Para el procesamiento del suero, las muestras se centrifugaron a 5000 × g durante 10 min, y el suero extraído se almacenó a −20 °C hasta la realización de los ensayos diagnósticos.

Se realizaron dos pruebas serológicas para detectar IgG anti-T. cruzi. Todas las muestras fueron sometidas a un tamizaje inicial mediante un ELISA de elaboración propia, utilizando como antígeno un extracto proteico total preparado a partir de aislamientos de T. cruzi (I.RHO/CO/00/CAS-15.CAS; I.TRI/CO/03/MG-8.MAG). Muestras previamente confirmadas como positivas y negativas se utilizaron como valores control para determinar los límites de DO de seropositividad y seronegatividad. Los valores de DO superiores a 2 desviaciones estándar (DE) del promedio de DO de los controles negativos se consideraron seropositivos. Todas las muestras positivas por ELISA se confirmaron mediante una prueba de anticuerpos por inmunofluorescencia (IFAT), con un título de 1:40 como punto de corte positivo. Las muestras seropositivas en ambas pruebas se consideraron seropositivas para T. cruzi [35].

Estudio de hospederos silvestres y detección de Trypanosoma cruzi en pequeños mamíferos

Los pequeños mamíferos se capturaron utilizando 10 trampas cebadas (5 Tomahawk y 5 Sherman) con una mezcla de maní, banano, avena y pescado. En cada vereda se colocaron diez trampas durante tres noches en áreas peridomiciliarias, incluyendo estructuras permanentes o temporales construidas y utilizadas por los seres humanos o sus animales domésticos. Las trampas se distribuyeron en transectos lineales, con puntos de captura establecidos a 20 m de distancia entre sí. Los mamíferos silvestres fueron anestesiados por vía intramuscular (clorhidrato de ketamina al 10% y xilacina al 2%, en proporción 9:1), según lo descrito por Roque et al. [36]. Se recolectaron muestras de sangre, que se almacenaron para la extracción de ADN y el análisis molecular. Además, se inocularon dos tubos con medio NNN cubierto con una capa de LIT con 0.3 a 0.6 mL de sangre. Los tubos se examinaron semanalmente durante tres meses para detectar la presencia de Trypanosoma spp.

Análisis molecular de muestras de triatominos, seres humanos y mamíferos

Todos los triatominos recolectados, las muestras de perros, las muestras de seres humanos seropositivos, las muestras de sangre total de Didelphis marsupialis y los hemocultivos positivos fueron analizados para detectar T. cruzi mediante PCR cuantitativa en tiempo real cualitativa (qPCR) dirigida al ADN satélite [37]. El ADN humano se extrajo a partir de 200 µL de sangre total con EDTA utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. El ADN total se diluyó con 100 µL de tampón de elución y se almacenó a −20 °C hasta el diagnóstico molecular. La PCR se realizó en un volumen final de 25 µL que contenía 40–50 ng de ADN genómico, 1X de tampón, 0.04 mM de dNTP, 1.5 mM de MgCl₂, 0.4 µM de cada cebador (TCZ1 y TCZ2) y 0.05 U de ADN polimerasa Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las condiciones de ciclado térmico fueron: precalentamiento a 95 °C durante 15 min, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 10 s, 55 °C durante 15 s y 72 °C durante 10 s, en un termociclador [38].

Las muestras positivas para T. cruzi fueron analizadas para la discriminación molecular entre las unidades discretas de tipificación (DTU) de T. cruzi, con base en la amplificación de la región intergénica del gen del líder empalmado (SL-IR), utilizando los cebadores TCC, TC1 y TC2, según lo reportado previamente [39]. La segunda PCR se realizó en un volumen final de 25 µL que contenía 40–50 ng de ADN genómico, 1X de tampón, 0.25 mM de dNTP, 2 mM de MgCl₂, 0.4 µM de cada cebador y 0.05 U de ADN polimerasa Taq (Invitrogen). Las condiciones de ciclado térmico fueron: precalentamiento a 94 °C durante 5 min, 35 ciclos a 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s, y una extensión final a 72 °C durante 5 min, en un termociclador. Los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV.

Cuantificación de T. cruzi, calibración estándar, límite de detección y carga parasitaria en triatominos, seres humanos y caninos

Para las muestras de seres humanos seropositivos y de perros domésticos se utilizó un protocolo de qPCR para la cuantificación de T. cruzi evaluado y validado, desarrollado por Ramírez et al. 2015 [40]. Para los triatominos recolectados en campo se utilizó un protocolo estandarizado de qPCR que incluyó la calibración estándar, el límite de detección (LOD) y la carga parasitaria reportados por Velásquez-Ortiz et al. 2022 [30]. Se utilizaron tripomastigotes metacíclicos de la cepa de T. cruzi MHOM/CO/04/MG (TcI), como se informó previamente. Los parásitos fueron aislados y cuantificados para obtener 10¹¹ parásitos por mL. Los reactivos de qPCR incluyeron TaqMan Fast Advanced Master Mix 2× (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), agua, y los cebadores cruzi1 (0.75 µM) (5′-AST CGG CTG ATC GTT TTC-3′), cruzi2 (0.75 µM) (5′-AAT TCC TCC AAG CAG CGG ATA-3′) y una sonda cruzi3 (0.05 µM) (FAM-CAC ACA CTG GAC ACC AA-NFQ-MGB), dirigidos al ADN satélite (166 pb) [38]. Las condiciones de la reacción fueron: 50 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos y 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos y 58 °C durante 1 minuto. El gen nuclear 28S rDNA se utilizó como control interno de amplificación mediante qPCR, con los cebadores D2F (5′-GCG AGT CGT GTT GCT TGA TAG TGC AG-3′) y D2R (5′-TTG GTC CGT GTT TCA AGA CGG G-3′), siguiendo las condiciones descritas anteriormente [41]. Se utilizó el software Real-Time Quant Studio Design and Analysis (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.) para calcular automáticamente el número de parásitos por muestra, utilizando las ecuaciones de regresión lineal obtenidas de la curva estándar.

Fuentes de alimentación sanguínea de los triatominos

Las fuentes de alimentación sanguínea de los triatominos se evaluaron mediante PCR dirigida a los genes 12S rRNA de vertebrados, y se obtuvieron mediante la amplificación de un fragmento de 215 pb utilizando los cebadores L1085 (5′-CCC AAA CTG GGA TTA GAT ACC C-3′) y H1259 (5′-GTT TGC TGA AGA TGG CGG TA-3′) [42]. La electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 1.5% teñido con SYBR Safe y se visualizó bajo luz UV en un generador de imágenes moleculares Gel DOC™ XR+ con el software Image Lab (Bio-Rad Laboratories Inc., California, EE. UU.). Las secuencias resultantes en ambas direcciones fueron editadas en el software MEGA X, ensambladas y revisadas manualmente en todos los cambios de bases según la calidad de los picos (altura, ausencia de superposición y espaciado uniforme). Posteriormente, las secuencias se enviaron a BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) para la búsqueda de similitud, definiendo cada especie con un porcentaje de identidad superior al 98% y un valor e cercano a 0.00.

Análisis estadístico y enfoques geoespaciales

Se evaluaron los factores de riesgo asociados con la domiciliación, definida como la presencia de adultos o de ninfas dentro de las viviendas o en las estructuras peridomiciliarias [43]. Los índices entomológicos se determinaron según los siguientes cálculos descritos por la OMS: 1) índice de infestación: (número de viviendas infestadas por triatominos / número de viviendas examinadas) × 100; 2) índice de colonización: (viviendas con ninfas de triatominos / número de viviendas positivas para triatominos) × 100; 3) índice de densidad: (número de triatominos capturados / número de viviendas examinadas); 4) índice de hacinamiento: (número de triatominos capturados / número de viviendas con triatominos); y 5) índice de infección natural: (número de pools infectados / número total de pools analizados) × 100. Se empleó la encuesta nacional transversal estandarizada sobre el riesgo de enfermedad de Chagas en Colombia [44] para evaluar los factores de riesgo conocidos asociados. El cuestionario identifica diferentes factores de riesgo en los hogares, incluidos los materiales de construcción de las viviendas, las características del peridomicilio y la presencia de animales en el hogar. Las comparaciones proporcionales entre valores seropositivos por sexo y edad se realizaron mediante la prueba de chi cuadrado, con un nivel de significancia menor a 0.05. Se realizaron análisis de regresión de Poisson univariables para evaluar las características de la encuesta de los hogares asociadas con el número de triatominos recolectados en cada localidad. El análisis de datos se realizó con R Studio, R versión 4.3.1 (Free Software Foundation, Boston, MA, EE. UU.).

Los mapas base se extrajeron de la base de datos GADM (www.gadm.org). Se utilizó Google Earth v.2.5 para determinar las coordenadas de todos los municipios donde se recolectaron triatominos y muestras de perros domésticos. Las coordenadas de cada localidad de estudio se capturaron con un dispositivo GPS (Sistema de Posicionamiento Global) portátil. Las coordenadas se registraron en el Datum WGS 84 (World Geodetic System 1984), sistema de coordenadas geodésicas. La visualización geoespacial se realizó en ArcGIS Pro 3.1.3 (ESRI, Redlands, CA, EE. UU.).

Resultados

Encuesta entomológica, tasa de infección por T. cruzi y fuentes de alimentación sanguínea

Se recolectaron en total 38 chinches triatominas en las seis veredas evaluadas (Tabla 1). Alrededor del 68.4% (26/38) de los triatominos recolectados fueron Triatoma venosa, el 29% (11/38) fueron Panstrongylus geniculatus y el 2.6% (1/38) fueron P. rufotuberculatus. Del total de triatominos, el 76% (29/38) se recolectó dentro de las viviendas y el 23.6% (9/38) en hábitats peridomiciliarios (alrededores de las viviendas, incluidos gallineros, establos, pilas de leña y pilas de rocas). Se recolectaron diez ninfas de T. venosa dentro de viviendas en Matarredonda Abajo. Las especies de triatominos se distribuyeron de forma heterogénea: T. venosa se encontró en Arrayán, Chapacía y Matarredonda Abajo; P. geniculatus en Morro Abajo, Pueblo y Cajón y Suna Abajo; y P. rufotuberculatus en Pueblo y Cajón (Figura 2). Se encontraron triatominos infectados con T. cruzi en las seis veredas. El índice general de infestación domiciliaria fue del 11.2% (9/80), con un índice de colonización del 33.3% (3/9), un índice de densidad de 0.48 y un índice de hacinamiento de 4.22. Los índices de infestación más altos se observaron en Suna Abajo, con 17.6% (3/17), y en Matarredonda Abajo, con 16.6% (2/12), mientras que el índice de densidad más alto se registró en Matarredonda Abajo (0.5). Entre los ejemplares de T. venosa capturados, el 88% (22/25) fue positivo para T. cruzi mediante qPCR. Además, el 100% (12/12) de P. geniculatus y el 100% (1/1) de P. rufotuberculatus resultaron positivos para T. cruzi. Todos los ejemplares positivos para T. cruzi se confirmaron como pertenecientes a la DTU TcI. La carga parasitaria mediana entre los triatominos positivos fue de 28 774 446 pe/mL. P. geniculatus presentó la carga parasitaria más alta, con una mediana de 57 406 337 pe/mL (rango entre 1103 y 196 175 888 pe/mL), seguido de T. venosa, con una carga parasitaria mediana de 142 555 pe/mL (rango entre 319 y 1 784 826 pe/mL). Por último, el ejemplar de P. rufotuberculatus recolectado presentó una carga de 163 841 728 pe/mL (Tabla 1). Se encontraron cuatro fuentes de alimentación sanguínea entre 13 triatominos (10 T. venosa y 3 P. geniculatus). Homo sapiens fue la fuente de sangre más frecuente para Triatoma venosa, lo que sugiere que los seres humanos son una fuente importante de sangre para esta especie, seguidos por los gatos (Felis catus). La sangre humana se detectó en ejemplares recolectados en el interior de las viviendas, mientras que la sangre de gato se detectó en insectos recolectados en el peridomicilio. En Chapacía y Arrayán, los seres humanos fueron la única fuente de sangre identificada para estas especies. En cuanto a P. geniculatus, las fuentes de sangre identificadas fueron toros (Bos taurus) y murciélagos (Molossus barnesi) (Tabla 1). Se detectó sangre de vaca en ejemplares peridomiciliarios de P. geniculatus recolectados en Morro Abajo. En la vivienda donde se recolectaron los ejemplares no había establos para ganado, pero sí existían estas estructuras en las casas vecinas. Asimismo, un ejemplar recolectado en Pueblo y Cajón tuvo como fuente de sangre un murciélago.

ND = no determinada, para los triatominos que no tenían una alimentación sanguínea reciente.

Figura 2. Distribución de la infección por Trypanosoma cruzi según la ubicación geográfica, el hospedero y los vectores. El mapa fue generado con Google Earth v.2.5 y el mapa base de los límites municipales se obtuvo de GADM. Los símbolos de los triatominos se descargaron como archivo GIF de BioRender y se incorporaron como vectores en los mapas usando las coordenadas de las viviendas. Disponible en el artículo original: enlace.

El análisis de regresión de Poisson univariable se presenta en la Tabla S1. En el modelo no ajustado se observaron asociaciones positivas significativas entre el número de triatominos capturados y la presencia de paredes repelladas y sin repellar, techos de teja de barro, teja de fibrocemento o madera, pisos de tierra o madera, gallinero, establo, corredor, horno exterior, presencia de zarzo (compartimento de almacenamiento en el techo), grietas en las paredes y mayor número de bombillas en el exterior del predio. El número de triatominos capturados también se asoció positivamente con la posesión de gallinas y conejos, y con la observación de roedores, especialmente alrededor de la vivienda. El tipo de entorno asociado positivamente con el número de triatominos fue el bosque que rodea las viviendas. En cambio, el número de triatominos capturados se asoció negativamente y de forma significativa con el tiempo de residencia en la vivienda, las paredes parcialmente repelladas, los techos de zinc, la presencia de un granero fuera de la casa, las pilas de leña alrededor de la vivienda, la posesión de gatos, la observación de zarigüeyas alrededor de la casa, la presencia de arbustos, árboles o plantas epífitas alrededor de la vivienda y el hecho de vivir en un área rodeada de pastizales.

Seroprevalencia de la infección por T. cruzi en seres humanos

Se recolectaron 155 muestras de suero humano de participantes con edades entre 4 y 93 años, de los cuales 82 (52.9%) eran mujeres y 73 (47.1%) hombres (Tabla 2). El número de personas incluidas por vivienda varió de una a siete. Un total de 14 pacientes fueron positivos en dos pruebas serológicas, lo que corresponde a una seroprevalencia general del 9.03% (IC 95%: 5.0–13.8%). La seroreactividad por sexo y vereda se muestra en la Tabla 2. No hubo diferencias significativas entre las tasas de seropositividad y el sexo o la edad. No se encontró evidencia de infección en pacientes menores de 14 años, y la seroprevalencia más alta se observó en el grupo de 70 a 80 años (21%). Además, no se detectó ADN de T. cruzi en las muestras humanas seropositivas, lo que sugiere una infección crónica.

Se identificaron personas seropositivas en Chapacía, Morro Abajo, Pueblo y Cajón y Suna Abajo. Morro Abajo, Suna Abajo y Chapacía presentaron las seroprevalencias más altas, de 22.2% (4/18), 11.3% (5/44) y 11.1% (4/36), respectivamente. Pueblo y Cajón tuvo una seroprevalencia menor, de 4.3% (1/23), mientras que Arrayán y Matarredonda Abajo no presentaron infecciones humanas (Tabla 2).

Características de los hogares

De las 80 viviendas evaluadas, el 17.5% tenía un residente seropositivo, el 11.3% (9/80) tenía triatominos dentro o alrededor de la vivienda y el 22% informó haber visto triatominos dentro o alrededor de la vivienda en el último año. Entre los hallazgos más importantes, la habitación fue el área interior más común con presencia de triatominos, las paredes de ladrillo fueron el material más frecuente en las paredes, los perros fueron el animal doméstico más frecuente en la vivienda, y las ratas y la zarigüeya D. marsupialis fueron los mamíferos silvestres más observados. Otras características de los hogares y del peridomicilio se describen en la Tabla S2.

Infección por T. cruzi en perros

Se evaluaron 58 perros domésticos en este estudio. La edad media y la desviación estándar de los perros fue de 5.04 ± 3.37 años (rango entre 6 meses y 13 años) (Tabla 3). Un total de 13 perros (22.4%) fueron seropositivos para T. cruzi en las pruebas ELISA e IFAT. Se identificaron perros seropositivos en Chapacía, Matarredonda Abajo y Suna Abajo. Los perros seropositivos tenían entre 2 y 12 años; el 53.8% (7/13) eran hembras y el 46.2% (6/13) machos (Tabla 3). Además, el 61.5% (8/13) de los perros seropositivos tenía ADN de T. cruzi en la sangre. Solo los perros infectados de Matarredonda y Suna Abajo fueron positivos por PCR. Por último, todos los perros positivos por PCR estaban infectados con TcI, con una carga parasitaria mediana de 358.3 pe/mL. Todos los perros positivos por PCR procedían de viviendas diferentes, excepto dos que pertenecían a la misma vivienda (Tabla S3).

Infección por T. cruzi en mamíferos sinantrópicos

Se capturaron siete individuos de D. marsupialis en áreas peridomiciliarias de Arrayán, Chapacía, Matarredonda Abajo y Pueblo y Cajón. Tres D. marsupialis capturados en Arrayán, Matarredonda Abajo y Pueblo y Cajón presentaron evidencia de infección por T. cruzi, y dos tuvieron hemocultivos positivos, procedentes de Matarredonda Abajo y Pueblo y Cajón. En los ejemplares positivos se detectó TcI.

Visualización geoespacial

La distribución geográfica de T. cruzi mostró distintos patrones: Matarredonda Abajo presentó un alto índice de infección en T. venosa, así como perros positivos por PCR y un D. marsupialis infectado. De manera similar, en Chapacía se encontraron T. venosa infectados, muestras humanas y caninas seropositivas, y D. marsupialis infectados. Por otro lado, Suna Abajo presentó altos índices entomológicos para P. geniculatus, algunos de ellos positivos para T. cruzi, además de seres humanos seropositivos y perros positivos por PCR. Asimismo, una vivienda en Suna Abajo tenía triatominos positivos, un perro positivo por PCR y una persona seropositiva; dos viviendas en Suna Abajo, una en Arrayán y una en Pueblo y Cajón tenían triatominos positivos y perros seropositivos. Finalmente, en Pueblo y Cajón se identificaron P. geniculatus infectados, seres humanos y perros seropositivos, y D. marsupialis positivos (Figura 2). Los mapas de superficie de datos también permitieron identificar posibles focos de transmisión, relacionados con las veredas donde coinciden triatominos infectados que se alimentan de seres humanos, perros infectados y mamíferos sinantrópicos positivos (Figura 2).

Discusión

Las infestaciones domiciliarias y el comportamiento intrusivo de las especies de vectores nativos son los principales desafíos de los programas de control de la transmisión de T. cruzi, una vez interrumpida la transmisión por los vectores primarios T. infestans y R. prolixus [7,45–47]. Tras la eliminación virtual de R. prolixus en el departamento de Boyacá, especies nativas como T. dimidiata, T. venosa y P. geniculatus están surgiendo como vectores secundarios que mantienen el ciclo de transmisión de T. cruzi [26,30,31]. Sin embargo, se ha investigado poco sobre la transmisión humana de T. cruzi y el riesgo renovado de infección debido a estos nuevos escenarios [22,35]. Los resultados presentados demuestran la existencia de riesgo de transmisión de T. cruzi por vectores nativos y por reservorios mamíferos hospederos en el departamento de Boyacá, Colombia. No se encontraron evidencias que confirmen la transmisión humana; no obstante, el presente estudio discute pruebas sobre la existencia de un ciclo de transmisión activo con intrusión en Miraflores, que pone a la población en riesgo de activación de la transmisión vectorial tras la eliminación de R. prolixus.

En el presente estudio se identificó una seroprevalencia de T. cruzi del 9.0% en seres humanos del área rural del municipio de Miraflores. Esta cifra es superior a las estimaciones de seroprevalencia reportadas para Colombia y otros países, donde estudios previos mostraron valores entre 2.5% y 7.8% [25,32,48,49]. Las diferencias de edad en las poblaciones muestreadas podrían explicar las distintas tasas de seroprevalencia. Otra explicación de esta discrepancia sería la reactivación histórica de la transmisión, debida a ciclos peridomiciliarios recientemente establecidos por vectores nativos y secundarios que no han sido objeto de intervenciones de control vectorial. En Brasil se han identificado escenarios similares en zonas donde las especies nativas adquieren mayor relevancia por su mayor presencia en el ambiente doméstico [50]. En este estudio, los triatominos estuvieron más presentes en hogares con refugios típicos, como techos de teja, pisos de madera o estructuras exteriores que ofrecen protección, como gallineros, establos o depósitos de leña, factores históricamente asociados con la presencia de triatominos [51]. La presencia de refugios favorables a los triatominos en los peridomicilios supone un reto especial para los esfuerzos de control vectorial, y la falsa percepción de la eficacia de los métodos puede favorecer la persistencia de vectores nativos en los alrededores de las viviendas [52]. Minuzzi-Souza et al. demostraron que los triatominos sinantrópicos mantienen el riesgo de transmisión de T. cruzi en regiones con bajos esfuerzos de vigilancia, lo que resalta la importancia de los hallazgos de este estudio [53]. La presencia de triatominos infectados en el domicilio y el peridomicilio en este estudio requiere mayores esfuerzos de vigilancia y control para reducir la probabilidad de reactivación de la transmisión de T. cruzi en Miraflores.

Aunque se observó transmisión peridomiciliaria de T. cruzi, el presente estudio no identificó evidencias de transmisión de T. cruzi en los residentes humanos tras la eliminación intradomiciliaria del vector R. prolixus. No se encontró infección en residentes menores de 14 años, y las muestras seropositivas fueron negativas para ADN, lo que sugiere la ausencia de infección aguda. Hallazgos similares se observaron en Brasil, donde Pavan et al. (2023) señalaron que la falta de infección aguda limita la vigilancia, a pesar de las condiciones favorables para el mantenimiento de la transmisión de T. cruzi [48]. No obstante, la expansión de especies vectoras nativas puede ampliar las áreas con riesgo de transmisión de T. cruzi, y las altas tasas de seroprevalencia en la población de mayor edad de nuestro estudio podrían ser consecuencia de la exposición acumulada a lo largo de la vida mediada por vectores, lo que subraya la necesidad de una vigilancia epidemiológica constante para identificar futuros casos activos de transmisión [46,54].

El escenario epidemiológico descrito puede relacionarse con la eliminación virtual de R. prolixus. Los informes previos no proporcionaron índices entomológicos sobre infestación e infección por T. cruzi en otros vectores, por lo que una falsa percepción de la eliminación de la transmisión de T. cruzi podría haber incrementado el riesgo de reactivación [7,55,56]. Según Ferreira y colaboradores, una correcta interpretación de los índices entomológicos puede ayudar a determinar el riesgo de transmisión de T. cruzi, ya que algunos vectores son menos eficientes que otros para transmitir el parásito [57]. En Boyacá, la transmisión de T. cruzi podría estar relacionada con otras especies epidemiológicamente relevantes, como T. venosa y P. geniculatus. De hecho, existe evidencia en todo Boyacá de que las especies emergentes muestran comportamiento intrusivo tras intervenciones químicas domiciliarias [26,31]. Una situación similar se describió en Brasil, donde existe una distribución superpuesta de especies domésticas y silvestres infectadas (por ejemplo, T. petrocchiae y T. pseudomaculata con T. brasiliensis) que invaden o colonizan viviendas humanas. Estas especies se alimentan de seres humanos y animales domésticos, lo que aumenta el riesgo de transmisión de T. cruzi y puede favorecer la adaptación progresiva de especies silvestres a ambientes antropizados [57–59].

Los perros domésticos se consideran centinelas útiles para muchas enfermedades zoonóticas, y son importantes para la epidemiología de la enfermedad de Chagas porque su parasitemia puede indicar puntos calientes de transmisión de T. cruzi [36,60]. En este estudio, los perros tuvieron una seropositividad del 22.4%, superior a la reportada en estudios previos en perros de Colombia: se informó una seroprevalencia del 4.6% en Boyacá, en un municipio con infestación por T. dimidiata [31], y del 5% en Valledupar [61]. Por otro lado, estudios con alta infestación por T. venosa encontraron una seropositividad del 44.1% con un 36.4% de positividad por PCR en Boyacá, y del 27.9% de seropositividad y 43.3% de positividad por PCR en Santander [26,62]. Dados los resultados obtenidos en los perros de Miraflores, la mayor infección y carga parasitaria de T. cruzi podría ser evidencia de transmisión activa del parásito, especialmente en Suna Abajo, donde se encontraron triatominos positivos para T. cruzi y un perro positivo por PCR en el mismo hogar. Las veredas Matarredonda Abajo y Suna Abajo deberían recibir mayor atención, ya que los perros infectados presentaron T. cruzi TcI, una unidad discreta de tipificación asociada con efectos cardíacos negativos [63,64].

Rhodnius prolixus no se encontró en el presente estudio, lo que confirma su eliminación intradomiciliaria por los esfuerzos previos [29]. Sin embargo, T. venosa, considerada un vector nativo de menor relevancia epidemiológica en Colombia, presenta ciertas características eco-epidemiológicas que permiten el mantenimiento de la transmisión de T. cruzi en el valle de Tenza, en Boyacá [26]. En la presente investigación, esta especie fue la más capturada y la única que mostró capacidad de colonización, con una tasa de infección por T. cruzi superior (92%, frente al 13.9% en el valle de Tenza) [26]. Este escenario es preocupante, ya que la reactivación de la transmisión humana podría producirse pronto si no se proporcionan esfuerzos de vigilancia y control en la zona. Las otras dos especies encontradas en este estudio, P. geniculatus y P. rufotuberculatus, presentaron una tasa de infección del 100%, aunque se recolectaron pocos individuos, lo que limita la inferencia de la tasa de infección. La importancia ecológica de estas dos especies debe considerarse, ya que P. geniculatus es un vector frecuentemente asociado con brotes de transmisión oral en Colombia (con tasas de infección de hasta 40%) [39,65], y P. rufotuberculatus, a pesar de su distribución más restringida, se ha encontrado dentro de viviendas en otros departamentos [27]. Dado que todos los insectos positivos fueron identificados como TcI, con altas cargas parasitarias, y que existe evidencia de alimentación con sangre humana y de circulación en hábitats intra y peridomiciliarios, existe un posible aumento del riesgo de transmisión de T. cruzi para los residentes del área de estudio.

No se identificó transmisión humana reciente; sin embargo, la distribución geográfica de los casos humanos seropositivos, perros, triatominos y zarigüeyas indica áreas prioritarias para la intervención en salud pública. Las encuestas transversales son una herramienta cada vez más utilizada para el control de la enfermedad de Chagas, y el muestreo aleatorio de veredas con baja capacidad de vigilancia puede permitir una identificación rápida y una gestión de recursos en áreas de gran necesidad [55]. Las áreas geográficas con transmisión activa o previa se identificaron combinando pruebas serológicas y moleculares con la identificación de vectores y de hospederos domésticos y peridomiciliarios. Las zarigüeyas y los vectores activamente infectados se encontraron en Matarredonda Abajo, Pueblo y Cajón y Arrayán, lo que sugiere transmisión peridomiciliaria. Además, se encontraron perros infectados en Suna Abajo y Matarredonda Abajo, junto con vectores infectados y altas tasas de infestación vectorial, lo que justifica la necesidad de mejorar la vigilancia para identificar un posible riesgo de transmisión. Las altas tasas de infestación por vectores positivos para sangre humana se encontraron en Suna Abajo y Matarredonda Abajo, ambas áreas con perros positivos por PCR, lo que sugiere transmisión doméstica activa. Por último, Morro Abajo tuvo seres humanos seropositivos y vectores infectados, con evidencia de alimentación con sangre humana, lo que sugiere un posible riesgo de transmisión en la zona. Según la distribución geoespacial de los resultados, las regiones que requieren intervención prioritaria serían Matarredonda Abajo, Suna Abajo, Pueblo y Cajón y Morro Abajo.

Algunas limitaciones del presente estudio deben reconocerse, entre ellas: (i) hubo dificultades logísticas para llevar a cabo el muestreo de mamíferos durante más de tres días en todas las viviendas del estudio, lo que pudo afectar la no captura de roedores; (ii) no fue posible muestrear a todos los perros residentes de los hogares muestreados, ya que con frecuencia los perros no estaban presentes durante la visita o se habían escapado al intentar reclutarlos; (iii) dado el papel de los trabajadores de salud de la Secretaría de Salud de Boyacá en las recolecciones, no fue posible buscar triatominos en ecotopos silvestres, ya que su vigilancia se restringe a viviendas residenciales; (iv) el análisis de la fuente de sangre estuvo limitado por los controles de sangre de hospederos seleccionados para el análisis molecular, lo que redujo la detección del rango de hospederos. Como última limitación, el muestreo aleatorio y el tamaño reducido de la muestra podrían explicar los bajos niveles de infestación y la ausencia de identificación de transmisión humana; se requiere un muestreo adicional que incluya a los niños evaluados durante el proceso de certificación para detectar casos incidentes.

Conclusión

Esta investigación resalta la necesidad de seguir investigando los ciclos de transmisión de T. cruzi propagados por especies vectoras nativas en Miraflores, Colombia, una región certificada como libre de transmisión intradomiciliaria de T. cruzi mediada por R. prolixus. A pesar de los esfuerzos históricos de salud pública, los vectores secundarios se han convertido en un desafío emergente para el control contemporáneo de la enfermedad de Chagas. Se encontraron vectores secundarios nativos infectados en Miraflores, dentro y alrededor de las viviendas, incluidos T. venosa, P. geniculatus y P. rufotuberculatus. Las tasas actuales de seroprevalencia encontradas en seres humanos fueron ligeramente superiores a las estimaciones nacionales, lo que resalta la necesidad de evaluar a una población más amplia. Aunque no se identificó evidencia de transmisión humana reciente, algunas áreas fueron identificadas como de alta prioridad para la intervención en salud pública por su alto riesgo de transmisión doméstica activa: Matarredonda Abajo, Pueblo y Cajón, Suna Abajo y Morro Abajo. La evidencia de que los vectores triatominos, los perros domésticos y D. marsupialis están infectados en la región resalta la necesidad de redirigir la atención de salud pública para evaluar el riesgo de transmisión humana. Este estudio demuestra que, si bien los programas históricos de control de triatominos tuvieron éxito en la eliminación de los vectores primarios, los vectores secundarios están surgiendo en su lugar y son competentes para la transmisión actual de la enfermedad. Las intervenciones de salud pública para mitigar la enfermedad de Chagas siguen estando justificadas hoy.

Información de apoyo

• Tabla S1. Variables asociadas de forma significativa con el número de triatominos capturados dentro del hogar. Muestra los resultados de la regresión de Poisson para las características de los hogares y el número de triatominos recolectados en cada hogar que fueron estadísticamente significativos (p < 0.05).
• Tabla S2. Respuestas de los participantes de la encuesta (jefe de hogar), comparadas con las de los hogares que proporcionaron muestras humanas o caninas. Describe las respuestas de la encuesta de cada jefe de hogar, comparando a quienes participaron en la entrega de muestras biológicas con el total de hogares muestreados. No se realizó comparación estadística entre el subconjunto y la muestra total.
• Tabla S3. Resumen de seres humanos, perros y triatominos infectados y seropositivos por hogar y ubicación. Muestra el desglose de las muestras recolectadas por hogar que resultaron positivas o seropositivas, y la ubicación de la que provienen.

Declaraciones de los autores originales

Financiación. Este trabajo fue apoyado por Minciencias-Colombia (convocatorias n.° 1115-2023 y 75-2023, a OCB) y por la Oficina del Vicepresidente de Investigación de la Universidad de Carolina del Sur (subvención n.° 80005643, a MSN). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recolección y el análisis de los datos, la decisión de publicar ni la preparación del manuscrito. Minciencias-Colombia brindó apoyo salarial a OCB y SZ, y la Oficina del Vicepresidente de Investigación de la Universidad de Carolina del Sur lo brindó a LGG y MSN.

Conflictos de interés. Los autores declararon que no existen conflictos de interés.

Ética. El Comité de Ética en Investigación (16 de noviembre de 2021) y el Comité de Experimentación Animal (9 de diciembre de 2021) de la Universidad de Antioquia aprobaron la participación de seres humanos y de animales, respectivamente. Todos los participantes adultos firmaron el consentimiento informado y, en el caso de los menores de 18 años, lo firmaron sus padres o tutores. Los animales se manejaron conforme a las buenas prácticas de bienestar animal establecidas por la Ley 84 de 1989 de Colombia.

Disponibilidad de los datos. Un conjunto de datos codificado, sin identificadores de salud privados, está disponible en openICPSR; su descarga requiere cumplir los requisitos de acceso de ICPSR.

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